一、實驗目的
通過檢測處于凋亡狀態(tài)的細胞數量來檢驗目的基因與細胞凋亡的關聯或者藥物對細胞凋亡的影響。
二、實驗原理
在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于細胞膜的內側，但在早期凋亡細胞中，PS 從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。
Annexin-Ⅴ能與 PS 高親和力結合。可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。用標記了 FITC 的 AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞壞死的過程中也會發(fā)生細胞膜損傷，壞死的細胞會結合 Annexin V-FITC。
Annexin V-FITC 通常與細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是 PI。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，PI 能夠透過細胞膜與細胞核結合呈現紅色。
將 AnnexinⅤ與 PI 匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。壞死細胞可以同時與 Annexin V-FITC 和 PI 結合顯色，而 PI 則被排除在活細胞 (FITC 陰性) 和早期凋亡細胞 (FITC 陽性) 之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的最后階段會像細胞壞死一樣發(fā)生整個細胞的解體，從而使凋
亡晚期的細胞也同時被 FITC 和 PI 結合染色呈現雙陽性。
三、實驗步驟
1. 待各實驗組 6 孔板細胞生長至覆蓋率約為 70% 時，收集上清，胰酶消化貼壁細胞，完quan培養(yǎng)基重懸成細胞懸液，與上清細胞收集于同一 5 mL 離心管中，每組設三個復孔 (為保證上機細胞數足夠，細胞數目 ≥ 5×105/處理）。若為懸浮細胞，直接收集。
2.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，用 PBS 輕輕重懸細胞；
3.1000 g 離心 5 分鐘，棄上清，加入 195μl Annexin V-FITC 結合液輕輕重懸細胞。
4. 加入 5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
6. 使用鋁箔進行避光，室溫 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分鐘，孵育過程中重懸細胞 2-3 次，隨后置于冰浴中。
7. 立即上機檢測
四、常見問題及解答
Q1：構建了慢病毒轉染的穩(wěn)轉株（帶綠色熒光），檢測凋亡使用 FITC 也是綠色熒光，是否會干擾？
A：會有干擾，可以換紅色熒光標簽的試劑進行檢測。
Q2：鏡下觀察有很多漂浮細胞，可以看到凋亡，為什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？
A：將漂浮的細胞收集起來再進行實驗
Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦顯微鏡下分別選擇的測量波長是多少？
A：綠色熒光可以使用 488nm 激發(fā)，PI 是紅色熒光，使用 535nm 激發(fā)
Q4：FITC 和 PI 孵育時間過短，對結果有什么影響？
A：孵育時間過短，影響裝載效果，時間過長，也要考慮細胞本身的狀態(tài)。
Q5：想問一下用流氏檢測應該怎么設門？
A：用陰性未染色的細胞調電壓，門設置，annexin V-FITC 單染、PI 單染來調補償。
